我們接著這個話題，通過一篇美國俄勒岡州立大學藥學院的研究論文，進一步討論緩沖體系對mRNA-LNP的影響，供大家參考。
該研究測試了三種常見生物緩沖液——HEPES、Tris和PBS——在單次凍融前后與DLin-MC3-DMA mRNA-LNP制劑的相容性。通過電子顯微鏡、差示掃描量熱法和膜流動性分析發(fā)現(xiàn)，不同緩沖液使LNP形態(tài)發(fā)生了不同的結構變化。采用體外和體內(nèi)模型測量mRNA轉染效率，發(fā)現(xiàn)Tris或HEPES緩沖液中的LNPs具有更好的冷凍保護效果以及與PBS相比更高的轉染效率。
該研究中LNP配方及表征方法
將螢火蟲熒光素酶(FLuc) mRNA用50 mM檸檬酸鈉緩沖液(pH 4)和分子級水稀釋，達到所需體積。將DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇和DMG-PEG-2000溶解在總脂質(zhì)濃度為5.5 mM的純乙醇(摩爾比為50:10:38:1.5)中，以3:1的體積比(水/乙醇)和9 mL/min的總流速通過標準微流控混合制備LNPs。
制備用于透析的HEPES、Tris和PBS（詳見下圖a，Tris即為Tris Buffer，HBS即為HEPES Buffer），其鹽度為150 mM, pH為7.4。配制后，立即將LNPs轉移到10個kDa MWCO盒中，并在各自的緩沖液中以1000倍的體積透析4小時和過夜。透析后，LNPs在Amicon Ultra離心過濾裝置中以3000g離心濃縮，分子量截止為100 kDa(Millipore Sigma, Burlington, MA)。
使用Zetasizer Nano ZSP對LNPs進行了水動力尺寸、多分散性指數(shù)和表面zeta電位的表征。對于Zetasizer分析，LNPs在各自的緩沖液中稀釋，得到三次測量結果。為了量化mRNA的包封效率和濃度，采用了改進的Quanti-iT RiboGreen RNA(Invitrogen)方案。
研究成果
1 緩沖液對LNP的形成和短期穩(wěn)定性的影響可以忽略不計
通過標準的微流體混合程序制備含有FLuc mRNA的LNP。DLin-MC3-DMA、DSPC、膽固醇和DMG-PEG-2000脂質(zhì)按50:10:38.5:1.5摩爾比混合，pH 4檸檬酸緩沖液中的mRNA溶液與乙醇脂質(zhì)混合物的體積比為3:1，總流速為9 mL/min。然后將所得的LNP懸浮液分成三等份，分別與PBS、Tris或HEPES進行透析。
透析后，將LNPs濃縮，并通過動態(tài)光散射(DLS)和改進的核糖綠測定法進行分析。
DLS分析顯示，三種緩沖液中LNPs顆粒大小幾乎相同，約為70 nm，PDI約為0.05。
位值表明，PBS和Tris配方的表面電荷略為負(約?3mV)，HEPES配方的表面電荷為中性，三種緩沖液中包封率均為>92%。
LNP的冷凍透射電鏡顯微照片也沒有顯示任何顯著的形態(tài)變化，這表明緩沖液對LNP的形成、形態(tài)或短期穩(wěn)定性的影響可以忽略不計。
3.2 低溫凍存復溶后，不同緩沖液中LNP關鍵表征出現(xiàn)差異
在- 20℃下保存三周后，將不同緩沖溶液中的LNPs在室溫下解凍30分鐘，立即用于研究。
①粒徑
儲存在HEPES和PBS中的樣品在FT后的平均粒徑增大了約50%，而儲存在Tris中的LNPs的粒徑減小了約10 nm。
②PDI
HEPES和Tris中LNPs的PDI在凍融前后基本保持一致，而PBS中LNPs在解凍后PDI增加了3倍（上圖b）。FT后Zeta電位也略有下降（上圖d）。
③LNP形態(tài)
LNP形態(tài)受到凍融的嚴重影響，冷凍透射電鏡證實PBS緩沖液中的 LNP在大小上最多樣化，并且顯示出高度異質(zhì)性的內(nèi)部組織，以及顆粒聚集。這可能是脂質(zhì)相和水相分離所導致。具體而言，PBS中的LNP包含典型的100 nm以下的致密LNPs，100~150nm的空脂質(zhì)體樣結構，以及不同粒徑包載水相的LNPs，其中部分水相中含有mRNA。
DLS分析顯示，Tris中的LNPs盡管觀察到形態(tài)變化，但尺寸和PDI沒有明顯變化，這表明相比于PBS，Tris可能可以更大程度地抑制LNPs顆粒的聚集。
與新鮮LNPs相比，HEPES中的LNPs在凍融后出現(xiàn)du特的沙漏狀結構，尺寸略大(見下圖e)。在LNPs周圍形成的水泡似乎缺乏mRNA，這可能表明HEPES可以影響mRNA周圍脂質(zhì)的堆積，例如，HEPES可以促進脂質(zhì)與mRNA之間更強的靜電相互作用——HEPES LNPs的zeta電位是真正的中性的，而PBS和Tris LNPs具有?2至?5 mV的輕微負電荷，這可能表明當HEPES存在時，mRNA電荷的中和作用更有效。
此外，基于冷凍顯微圖像研究了脂質(zhì)膜厚度的變化。
平均而言，脂膜厚度在FT后增加了15%，表明膜水合作用增加。
更具體地說，冷凍后，Tris LNPs的脂膜厚度增加了約0.8 nm, PBS增加了約0.6 nm, HEPES LNPs增加了約0.2 nm。尚不wan全清楚這些改變是否表明脂質(zhì)膜成分發(fā)生變化或僅僅是水摻入的結果，但這些結果突出了解凍后LNPs的脂質(zhì)膜發(fā)生了顯著變化，且不同緩沖體系中變化程度不同。
以上實驗結果表明，不同緩沖液對mRNA-LNPs的關鍵表征（形態(tài)、粒徑、PDI，脂質(zhì)膜厚度等）可以產(chǎn)生較大影響。
3.3 轉染能力與內(nèi)涵體逃逸的體外評估
①緩沖液影響LNP轉染能力
該研究評估了不同緩沖液中的LNPs的轉染能力和內(nèi)涵體逃逸的程度。分別用包封FLuc mRNA的LNPs處理hela和HEK293T/17(后者用Gal9-GFP報告系統(tǒng)修飾)兩個細胞系，并在24小時后檢測。無論使用何種緩沖液，細胞存活率均保持在80%(下圖a,c)。轉染評價表明，緩沖液的轉染效率隨細胞系的不同而變化。在HeLa細胞中，LNPs轉染趨勢為HEPES＞PBS>Tris(下圖b)，而HEK293T/17細胞表現(xiàn)出Tris>HEPES>PBS的偏好(下圖d)。
一般來說，所有的mRNA-LNP制劑在解凍后轉染效果都有所下降。在HeLa細胞中，PBS LNPs的轉染效率下降最為嚴重，在所有處理中平均下降4倍，而HEPES在所有處理中平均下降2倍(下圖b)。對于HEK293T/17細胞系, HEPES和PBS LNPs均無統(tǒng)計學意義的下降，而Tris在100和200 ng時的LNPs分別下降了2 ~ 2.5倍(下圖d)。
②緩沖液影響內(nèi)涵體逃逸效率
凝集素是一個與病原體入侵和免疫感知相關的糖結合凝集素家族。半乳糖凝集素如gal3、gal8和gal9從彌漫的細胞質(zhì)表達重新分布到暴露的糖苷位點，這是由于內(nèi)體內(nèi)小葉暴露事件造成的，表明內(nèi)涵體破壞。Gal9已被證明在報告細胞內(nèi)涵體逃逸的檢測中具有最高的信噪比。因此，可利用Galectin 9 (Gal9)- gfp 修飾的HEK293T/17細胞系，評估FLuc mRNA LNPs的內(nèi)涵體逃逸情況。
低劑量處理(50 ng)在所有新鮮LNPs中幾乎沒有變化，HEPES LNPs在FT后表現(xiàn)出最高的Gal9募集和zui顯著的變化(2.6倍)。
高劑量(200ng)處理組中，冷凍前Tris LNPs誘導了最高的Gal9募集。不同緩沖體系中的LNP對FT的反應wan全不同。PBS LNP減少了Gal9的招募，Tris LNPs幾乎沒有變化，HEPES LNPs增加了Gal9的招募。解凍后的HEPES LNPs內(nèi)涵體逃逸的增加可能是低溫透射電鏡觀察到的形態(tài)學變化的結果。LNP形態(tài)的變化導致體外轉染的增加，因此HEPES可能促進了解凍后LNP形態(tài)的有利變化。
這些體外實驗數(shù)據(jù)進一步支持了LNP緩沖液組成對凍融后轉染效率的重要性，并揭示了細胞攝取的差異受到這些變化的影響。
3.4 體內(nèi)成像評估m(xù)RNA表達情況
通過活體成像，探索了不同緩沖體系mRNA-LNP在體內(nèi)的表達情況。將HEPES、Tris和PBS LNPs靜脈注射到年齡匹配的雌性BALB/c小鼠中，比較熒光素酶的表達水平和器官特異性。在注射后4和24 h時間點測量新鮮和解凍的LNPs的生物發(fā)光信號。
在所有案例中，生物發(fā)光圖像顯示強烈的肝臟轉染模式，與通常的LNP靜脈注射制劑一致。
總體而言，HEK293T/17細胞系的體內(nèi)轉染趨勢與體外觀察到的相似(Tris > HEPES > PBS)。新鮮LNPs之間的交叉比較得出結論，與其他緩沖液相比，Tris組在給藥后4小時增加了2倍。這種功效的增強可能是由于脂質(zhì)膜上的水置換改善了apoe介導的攝取，正如脂質(zhì)膜厚度減少所表明的那樣。
然而，緩沖液導致了不同程度的轉染損失。對于給藥后4小時的FT組，HEPES顯示總通量減少約2倍，Tris顯示減少約3倍，PBS (LNP配方中最常見的緩沖液)導致總通量減少近9倍。
有趣的是，在24小時時間點，不同緩沖液樣品之間mRNA表達水平?jīng)]有統(tǒng)計學上的顯著差異。這可能是LNPs在血液中不斷循環(huán)，緩沖液作用減弱的結果。
總的來說，與先前的觀察結果一致，mRNA的傳遞受到凍融過程的影響。緩沖液對體內(nèi)給藥效果的巨大影響表明，在LNP制備中選擇適宜的生物緩沖液，或可為保持mRNA-LNP的理化性質(zhì)及生物學活性提供顯著優(yōu)勢。
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