之前，我們分享了海藻糖用于人源少突膠質(zhì)前體細胞（OPC）、脂肪來源干細胞、小鼠睪丸生精細胞等細胞類型冷凍保護的相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)向凍存液中添加一定量海藻糖或使用海藻糖+甘油復(fù)合型凍存保護劑，可以提升細胞長期凍存后的復(fù)蘇活率。

本期，我們分享一篇來自意大利米蘭的研究者們2018年發(fā)表在《Stem Cell Research》上的文獻，看一下海藻糖海藻糖如何冷凍保存人類多能干細胞？

1. 介紹

包括干細胞在內(nèi)的細胞**產(chǎn)品具有很高的臨床潛力，全球干細胞市場包括上中游的干細胞存儲制備以及下游的臨床應(yīng)用。根據(jù)全球透明市場研究機構(gòu)（Transparency Market Research）的報告，到2025年底，全球干細胞市場規(guī)模預(yù)計達到2705億美元，近8年全球干細胞市場的復(fù)合年增長率有望達到13.8%。

為了使細胞**產(chǎn)品成功應(yīng)用，細胞的長期低溫存儲是必須攻克的技術(shù)難點，因為低溫保存是長期保存細胞活力和生化功能的**可用方法。

為了避免細胞內(nèi)結(jié)冰對細胞結(jié)構(gòu)的損害，一些冷凍保護劑已經(jīng)上市。*常用的細胞冷凍保護劑是二甲基亞砜（DMSO）與胎牛血清或血清替代品聯(lián)合使用。

然而，胎牛血清含有異種動物源蛋白，可能會引起未知病原體的人畜共患**。此外，DMSO具有細胞毒性。據(jù)報道，DMSO對組織和細胞的毒性取決于暴露時間、溫度和濃度。毒性程度因細胞類型而異，在未去除DMSO的情況下再次注入解凍細胞的患者中有不良反應(yīng)的報道。此外，已知DMSO會通過調(diào)節(jié)三種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（Dnmts）的轉(zhuǎn)錄水平和改變?nèi)蚪M甲基化譜來影響小鼠胚狀體的表觀基因組，進而導(dǎo)致小鼠干細胞的不受控分化。因此二甲基亞砜+胎牛血清并不適合臨床使用，急需開發(fā)高效無毒的細胞冷凍保護劑。

 海藻糖是一種非還原性雙糖，存在于多種能夠在脫水狀態(tài)下存活的生物中，如細菌、酵母、緩步動物和線蟲。哺乳動物不產(chǎn)生海藻糖，但海藻糖確實是一種有效的冷凍保護劑，可以減少冰晶形成造成的細胞損傷。其保護作用既與滲透效應(yīng)有關(guān)，也與細胞膜磷脂和不穩(wěn)定蛋白的特異性相互作用有關(guān)，可防止其因干燥和氧化應(yīng)激而損傷和變性。

海藻糖不具有細胞毒性，已被有效地用于小鼠精細胞、成人造血干細胞，間質(zhì)干細胞，脂肪來源干細胞，人類胚胎干細胞（hESCs） 和人類誘導(dǎo)多能干細胞（hiPSCs） 等不同細胞類型的冷凍儲存。此外，海藻糖還用于臍帶血、骨髓、人類移植表肝細胞和人類胰島的冷凍儲存。

阻止海藻糖在細胞保存中廣泛應(yīng)用的主要障礙是其難以進入細胞內(nèi)部。以前已經(jīng)應(yīng)用了幾種方法，如滲透休克、脂質(zhì)體遞送、熱穿孔、電穿孔、微量注射和基因工程等方式來幫助海藻糖進入細胞內(nèi)部。然而，上述方法需要非常繁瑣的操作，費力耗時，且可能導(dǎo)致**的細胞損傷。

該研究探究了在沒有二甲基亞砜及胎牛血清的情況下，使用海藻糖單獨或與乙二醇(乙二醇)或甘油(甘油)聯(lián)合，配制了4種不同的海藻糖復(fù)合型冷凍保護劑，低溫保存3種不同類型的多能干細胞系并復(fù)蘇，對幾個關(guān)鍵參數(shù)進行了**研究，包括細胞形態(tài)、解凍后生存能力、多能性標記物表達水平、基因組穩(wěn)定性、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)穩(wěn)態(tài)、DNA損傷反應(yīng)等，以衡量不同海藻糖復(fù)合型冷凍保護劑對多能干細胞的低溫保護能力。

海藻糖（供注射用）（無菌）

1、產(chǎn)品名：海藻糖（供注射用）（無菌）

2、中文名稱：D(+)-海藻糖二水合物

3、英文名稱：D（+）-海藻糖二水合物（注射用）

4、化學(xué)名稱：α-D-吡喃葡萄糖基-α-D-吡喃葡糖苷二水合物

5、型號：Hipo-S

6、含量測定：99.3%

7、CAS號：6138-23-4

8、EINECS登錄號：202-739-6

9、備案登記號：F20190000452

10、DMF號：034401

11、質(zhì)量標準：符合各國藥典標準（Chp，USP，JP，EP）

12、分子式：C12H22O11·2H2O

13、分子量：378.33

14、性狀：白色結(jié)晶性粉末

15、比旋度：+198.8°

16、酸度:6.0

17、氯化物:符合規(guī)定

18、硫酸鹽:符合規(guī)定

19、可溶性淀粉:符合規(guī)定

20、熾灼殘渣:0.04%

21、重金屬:符合規(guī)定

22、水分:9.5%

23、有關(guān)物質(zhì):總雜0.06%，葡萄糖未檢出，麥芽三糖0.06%，**未知單雜未檢出

24、無菌：符合規(guī)定

25、微生物限度：無菌

26、細菌內(nèi)：<0.1IU/g

27、氮：符合規(guī)定

28、含量測定：99.3%

29、溶解性：易溶于水，溶于熱乙醇，微溶于甲醇，不溶于**、**

30、保存：密封、涼暗干燥處保存，常溫條件下運輸。

31、貨號：008001

32、結(jié)構(gòu)式：